2020-2026年高效液相色譜儀行業市場前景調研
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高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，?通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。
目前，全世界大約有近40多種高效液相色譜儀檢測器；現在主要給大家介紹幾種常用檢測器的現狀。
（1）紫外檢測器：紫外檢測器是高效液相色譜儀中最常用的檢測器。它是最廣泛使用的具有最廣泛覆蓋的檢測器，占HPLC檢測器覆蓋范圍的大約75％。基本上，它可以應用于所有具有紫外吸收的物質的分析和檢測。任何HPLC至少應有一個紫外檢測器。
（2）熒光檢測器（fld）：fld占高效液相色譜儀檢測器的15%左右，所有苯環類物質基本上都是致癌物和熒光物質，fld具有靈敏度高的優點，因此fld被廣泛應用。
（3）差示折射計(RID)：RID是一種高質量、非選擇性的檢測器，其覆蓋率約為HPLC檢測器的5%；然而，由于它受溫度的影響，環境溫度的微小變化將對檢測器的結果產生很大的影響。
（4）蒸發光散射探測器（ELSD）：ELSD近年來發展迅速，在許多領域得到了廣泛的應用。目前，它的使用范圍比RID大，所以很快就會取代RID。其覆蓋面積估計約為10%。
產品應用：?
一、生物化學：高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。據中金企信國際咨詢公布的《2020-2026年中國高效液相色譜儀行業市場發展戰略分析及投資前景專項預測報告》統計數據顯示：HPLC可將不同的蛋白質分離并檢測，不但有很高的靈敏度且實現了分析自動化，對醫藥、臨床病理、預防學等蛋白質化學領域的研究提供了強有力的手段。HPLC應用于細菌的分子生物學鑒定和細菌細胞的化學成分分析可直接測定細菌DNA的堿基組成和細菌的化學組分，為細菌的分類鑒定提供有利的證據。但是HPLC在具體分析的過程中還有很多問題有待解決。相信高效液相色譜這種分析方法隨著儀器分析技術的不斷發展必然將會對生物學領域做出更大的貢獻。
1、高效液相色譜法在微生物分析鑒定中的應用：HPLC應用于細菌的分子生物學鑒定和細菌細胞的化學成分分析可直接測定細菌DNA?的堿基組成和細菌的化學組分，為細菌的分類鑒定提供有利的證據。因此，HPLC?在微生物鑒定中的應用越來越受到人們的關注。?
（1）細菌DNA?的G+?C含量測定：每一種細菌DNA?G+?C含量通常是恒定的，不受菌齡、生長條件等各種外界因素的影響，故它作為鑒定細菌種、屬間的親疏關系的重要指標已被人們所公認。在伯杰細菌系統學手冊中將細菌DNA?G+C含量作為細菌分類鑒定的重要指標，可見細菌DNA的G+C含量測定在細菌鑒定中的重要性。DNA經酶水解后得四種堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，它們的化學結構中均存在共軛雙鍵，在260nm波長處有最大吸收，因此可用常見的UV—HPLC?法直接測定細菌DNA?G+C含量。測定DNA?G+C含量的方法已有眾多研究報道，主要包括熱變性溫度（Tm）法、浮力密度法和HPLC法，其中快速、準確的方法當HPLC法。
通常情況下，中性分子在反相色譜柱中具有更好的柱效。
HPLC測定細菌DNA?G+C含量是一個快速、準確可靠的方法。但是，在應用這個方法時應注意下列幾點：
細菌DNA應高度純化，按常規方法提取與純化的細菌DNA，不宜直接用HPLC測定G+C含量。樣品中殘留的RNA等明顯影響G+C含量測定的準確性，必須用核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1進一步處理。否則，較多的雜質峰將影響堿基峰的形成而使G+C含量測定出現較大誤差。
測定細菌DNA的脫氧核糖核苷酸或脫氧核糖核苷均可計算出DNA?G+C含量。但應注意，測定核苷酸時宜選用離子交換色譜系統，而測定核苷時宜選用反相色譜系統。?
熒光檢測器比紫外檢測器的靈敏度高，在條件具備或樣品量很低時，盡量選擇熒光檢測。
（2）枝菌酸的分析：枝菌酸是一類僅存手棒狀桿菌（C20～C38）、迪茨氏菌屬（C34～C38）、紅球菌屬（C34～C52）、諾卡菌屬（C40～C60）、戈登氏菌屬（C48～C66）、williamsia?（C50～C56）、Skermania?（C50～C64）、冢村氏菌屬（C64～C78）和分枝桿菌（C60～C90）細胞壁中的α2烷基、β2羥基高分子脂肪酸。二維薄層層析和質譜證實各種分枝桿菌中含不同的枝菌酸。HPLC?能夠分離各枝菌酸是基于枝菌酸碳鏈長度、不飽和度和其官能團，而HPLC分類、鑒定含枝菌酸細菌是基于各枝菌酸溴代苯甲酰脂肪酸酯的特征圖譜或保留時間不同。將樣品測定圖譜與已發表的分枝桿菌參考圖譜比較可進行鑒定，若沒有標準參考圖譜，可利用標準株或基因鑒定菌株制備。HPLC可鑒定分枝桿菌到種的水平。
HPLC是一個快速、簡便和費用低廉的種特異性鑒定分枝桿菌的方法，值得大力推廣應用。但是HPLC?鑒定分枝桿菌需要標準圖譜作為對照，鑒定時需要參考文獻圖譜，建議最好購買現成的分枝桿菌圖譜數據庫或自行建立數據庫并結合計算機輔助進行鑒定。隨著鑒定數量的不斷增加，可將鑒定到的新菌種圖譜不斷充實到數據庫中，使得鑒定范圍不斷擴大，從而使其真正成為在臨床或實驗室進行分類鑒定分枝桿菌的常規手段。?
（3）醌類的分析：醌是細菌細胞質膜和線粒體膜的組成成分，在電子傳遞鏈和氧化磷酸化中起重要作用。除了具有這些重要的生理功能，類異戊二烯醌作為細菌分類的重要化學指標常用于細菌的分類鑒定。許多研究表明細菌中含有的兩個主要類型的醌一萘醌和苯醌均具有類異戊二烯側鏈，而且側鏈各不相同，醌的類型（泛醌、甲基萘醌和它們的衍生物二氫甲基萘醌、二甲基甲基萘醌和深紅醌）、類異戊二烯側鏈長度和飽和度構成了化學分類鑒定細菌之基礎。高效薄層層析（HPTLC）可有效地分析泛醌類異戊二烯側鏈，但分析甲基萘醌類異戊二烯側鏈受到限制。反相薄層層析（RP-TLC）?雖能有效地分析甲基萘醌，但分析甲基取代的甲基萘醌不夠理想。高效液相色譜法（HPLC）在以上存在的兩種情況中均能有效地進行分析。以紫外檢測高效液相色譜儀、RPl8?柱（5μm粒徑，150×4.?6?mm）、270nm檢測波長分析醌。通過與可靠的標準品比較鑒定各種類型的醌，當用HPLC分析細菌中醌類鑒定細菌時，必須將測定樣品與標準品圖譜對照。因為HPLC分析醌類鑒定細菌是定性分析細菌中的醌，分析條件的微小變化都會影響某種醌保留時間的長短，使我們無法進行正確判斷。此外，僅靠一張HPLC圖譜就對細菌作出鑒定難免有些草率。因此，準確鑒定時，除了進行HPLC測定外，還應作紫外光譜、質譜和核磁共振譜分析。?
（4）多胺的分析：多胺是構成細菌細胞的化學成分，它的類型可作為細菌化學分類的標志。目前，已經證明多胺的類型可用于屬于蛋白菌類的革蘭氏陰性菌的分類鑒定，它在革蘭氏陽性菌分類鑒定中的作用還沒有得到完全證實。一般α-亞類蛋白菌主要含三胺（亞精胺或對稱一同系亞精胺）；β-亞類蛋白菌具有同系多胺類型，它們共同的特征為主要含丁二胺；γ-亞類蛋白菌腸桿菌科歐文菌屬主要含二氨基丙烷和丁二胺，相關的弧菌屬主要含三胺（對稱一正亞精胺）；黃單胞菌屬、弗拉特氏菌屬、鹽單胞菌屬、德萊氏菌屬和海洋螺菌屬的共同特征為主要含亞精胺，寡養單胞菌屬主要含戊二胺和亞精胺。將干燥菌置于試管中，加入一定量0.?2mol/?L?高氯酸，100℃加熱30min，離心后，上清液在60℃進行堿化和旦磺酰化，然后加脯氨酸溶液除去多余的旦磺酰氯，用甲苯抽提出旦磺酰多胺備用。采用RPl8色譜柱、熒光檢測器和乙腈/?水梯度洗脫系統進樣分析旦磺酰多胺。
多胺的分析可用于細菌的分類鑒定，但僅適用于某些革蘭氏陰性菌，況且僅依靠多胺的類型不能完全確定某種菌，因此用本法分類鑒定細菌時需與其它方法進行比較，防止得出錯誤的結論。?
2、利用高效液相色譜（HPLC）分離蛋白質：蛋白質在物理、化學及功能等特征上的差異為蛋白質的分離檢測提供了基礎。根據蛋白質的大小、形狀、電荷、疏水性、功能等特性以及蛋白質的來源、實驗要求等可以選擇不同的模式來分離目標蛋白質。?
（1）反相高效液相色譜：在HPLC各種模式中，RP-HPLC應用最為廣泛。其固定相是非極性的，而流動相是比固定相極性更強的溶劑系統。蛋白質分子疏水性的不同使其在兩相中的分配不同而得到分離。近10幾年來，RP-HPLC以其高分辨力、快速、重復性好等優點廣泛應用于蛋白質的分離分析。?
有利于蛋白質分離的條件于1970年首次提出，即低pH值流動相、室溫或較高的溫度及使用乙腈或異丙醇作為有機部分。三氟乙酸（?TFA）作為離子對試劑，是反相色譜中最常用的添加劑。蛋白質的保留性質和選擇性還與鍵合固定相的性質有關，實驗證明，大孔硅膠（20～30nm）短鏈烷基鍵合固定相適合蛋白質的分離；另外，無孔徑載體柱對分子量相差較大和疏水性很強的蛋白質混合物的分離效果很好。從分子量6000的胰島素到分子量66000的牛血清白蛋白在無孔徑載體柱上均能得到良好的分離，并且分離速度很快（一般2～5min），較高的柱溫還能改善蛋白質混合物的分離；Daniel?B.?Wall等利用C18非多孔硅粒載體柱實現了細胞溶菌物中蛋白質的快速分離。并且，利用這種方法，在15min內大腸桿菌的整個細胞溶菌物水溶液中的蛋白就可以得到很好的分離。?
（2）高效離子交換色譜：HPIEC是根據蛋白質分子在一定的pH和離子強度條件下所帶電荷的差異進行分離的方法。這種技術已經成功地用于分離蛋白質，并且，當選擇的流動相的?pH?值合適時能維持蛋白質的生物活性。由于HPIEC是一吸附性的梯度洗脫過程，所以具有很好的負載力。近幾年來HPIEC也成為分離檢測蛋白質的重要方法。并且，人們的研究證明HPIEC與RP-HPLC都是分離膜蛋白的首選方法。?在離子交換色譜填料研究方面，聚合物離子交換劑頗受重視。因為這種固定相具有穩定性好、離子交換容量大、對蛋白質的分離有選擇性等特點。
（3）高效凝膠過濾色譜：凝膠過濾色譜也稱體積排阻色譜（Size?exclusion?chromatography，SEC），是根據分子相對大小進行分離的一種色譜技術。相對于吸附性液相色譜技術而言，?SEC的分辨力和樣品負載力都很低。SEC又是一種溫和的技術，可用來平衡柱及分離樣品的緩沖液范圍較廣。所以近年來關于利用SEC?分離蛋白質的報道也不少。例如，Bunger?H等成功的分離出疏水性肺的表面活性劑蛋白SP-B、SP-C；另外SEC特別適合對蛋白質分子量的研究，利用SEC?能夠快速分離出人血清白蛋白HAS的降解產物，結合特定的檢測器即可測定其單體和二聚體的分子量。?
（4）高效親和色譜：蛋白質在行使功能時必須和底物、受體或抑制劑等分子進行生物專一性結合，這種高度專一性結合特性可用于親和色譜分離。HPAFC是蛋白質檢測中最專一的分離技術，可以從復雜的混合物中直接分離到目標蛋白質，特別適合疫苗、糖蛋白和抗體等的分離純化。周冬梅等研究了蛋白A高效親和色譜對水溶液及人血漿中免疫球蛋白G（HIgG）的特異性吸附和定量測定，方法具有較高的精確度和重復性。通過HPAFC可以分離純化酶、抗體、抗原、結合蛋白、受體蛋白、輔助蛋白等，也可以分離變性蛋白、化學改性蛋白等，可見HPAFC在蛋白質化學中起著重要作用。?
（5）其他液相色譜模式：高效疏水色譜（HIC）是用來分離構象不穩定蛋白質的技術之一，其分離機制類似于反相液相色譜，只是用水性緩沖液代替了有機溶劑；以鍵合氟化物作固定相，用SDS或CTAB作流動相的膠束高效液相色譜中，膠束提供了一個溶質溶解的非均相環境，可用于蛋白質的分離；近年來，人們將非線性色譜理論應用于蛋白質分離中，更加完善了高效液相色譜技術。在實際應用中，特別是復雜樣品，通常采用幾種分離模式結合使用才能獲得理想的目標產物。?
3、蛋白質分離檢測的HPLC聯用技術：為了使蛋白質的檢測更加準確方便，人們研究了各種HPLC聯用技術。目前常用的比較成功的聯用技術主要有：高效液相色譜—質譜（HPLC-MS）、高效液相色譜—毛細管電泳（HPLC-CE）、高效液相色譜—等速電泳（HPLC-ITP）、高效液相色譜—電感耦合等離子體原子發射光譜（HPLC-ICP-AES）。?
（1）HPLC-MS聯用技術：HPLC-MS?聯用技術是近年來研究的熱點，通過質譜可以實現對蛋白質的自動分離檢測。隨著電噴霧（?ESI）接口技術的發展，HPLC-ESI-MS?聯用技術為蛋白質的檢測提供了強有力的工具。這種技術耗樣量少、精確度高、快速方便，并且可以用于不純或者復雜混合物的分析。我國研究工作者利用HPLC-ESI-MS聯用技術對溶菌酶和牛血清蛋白分別進行定性定量分析以及對其混合物進行檢測，取得了較滿意的結果。另外，HPLC-MS-MS?聯用因其通用性以及高靈敏度在蛋白質分析中也有著重要的應用。?
（2）HPLC-CE聯用技術：HPLC-CE聯用技術特別適合細胞或組織中蛋白質的分離。在分離檢測復雜蛋白質樣品時，HPCE可以作為HPLC的補充，有時利用HPLC無法分離的蛋白質在HPCE上即可得到很好的分離。另外，毛細管區帶電泳（CZE）與HPLC聯用也可以很好的分離檢測一些蛋白質。?
（3）HPLC?–?ITP聯用技術：高效液相色譜和等速電泳都是近年來發展較快的分離分析方法，二者聯用可以分離分析成分和復雜的蛋白質樣品。曾經有人將ITP作為一種預處理技術與?HPLC聯用，我國研究工作者建立了新的聯用系統，成功地研究了含蛋白質和一些金屬離子的復雜樣品的分離分析。?
（4）HPLC-ICP-AES聯用技術：ICP-AES是十分重要的化學形態分析技術，HPLC與ICP-AES的結合使之具有多元素同時檢測的特性。國外科學家利用此聯用技術對人類肝部的金屬硫蛋白中的金屬分布作了準確的定性定量分析。?
二、食品分析：食品中尤其是水果和蔬菜，都含有一定量的維生素C。
維生素C不但具有生理活性，而且在人體內能阻止亞硝胺的形成，具有一定的防癌作用。所以，分析食品中的VC含量，將對鑒別水果和蔬菜的營養價值及衡量保鮮程度具有重要的意義。
維生素C（也稱抗壞血酸）的定量分析在食品、藥物等領域相當重要，其測定方法很多，包括藥典中的標準方法-碘量法，還有比色法，電位滴定法，化學法。高效液相色譜分析VC也有報導。用高效液相色譜分析VC顯示出它快速準確的優點。在分析紅顏色樣品時，HPLC要比化學法準確得多。這就是HPLC分析VC的優越性之一。用HPLC分析VC的另一個優點就是可以直接進入液體樣品。
三、醫藥研究：
1、分離分析藥物的組分含量：由于一種藥劑常含有多組分，色譜方法是既能分離又能定量的方法。如脂溶性維生素片，含有鉻維生素，有C18柱及含1%碳酸銨的甲醇為流動相。一次即可將各維生素B6、D1、A、E同時分離并定出含量。又如止痛藥或退燒藥也可用此法分離并測得各組分的含量。?
2、藥物生產中進行中間控制：生產抗菌素時，首先要了解發酵液中的主體與付產物的存在情況。例如：青霉素、四環素、頭孢子菌素、紅霉素、柔紅霉素、慶大霉素等的發酵產物，均可用C18柱和甲醇及緩沖液配制的流動相或用離子對法，分析主體及其收產物的含量。對普魯卡因酰胺、茶堿等可進行主體含量的測定，對硝酸甘油可測定主體含量及其降解產物，以便保證藥物的熱量。?
3、分析藥物在體內的殘量：這是近來研究新藥效能很主要的內容之一，如冬凌草甲素是植物中的一組分，有抗癌效果，但是毒性大。測定其在血清中含量很重要，現在可用C18柱及甲醇水為流動相，測定處理后的血清樣品，即可得到血中的含量。如磺胺類藥品在血清及尿中含量也不允許太大，可用C18柱及酸性乙醇為流動相，測定含量后，則可估計最合適的用藥劑量。又如四環素、巴比妥酸、止痛藥、退燒藥、護糖尿病的藥物等，在血或尿中的含量都可用C18柱用甲醇、水為流動相來測定含量。因此，反相色譜法應用范圍極廣。?
4、測定藥物在各種器官中的代謝產物，特別是研究藥物的代謝產物在血清中存在的情況。如測血清中的酮酸及戊二酸。測尿中代謝產物更為方便，不需要繁鎖的預處理。因為研究尿中的組分能鑒別病人的代謝功能，對病理研究或監床診斷均具有重要的參考價值。
四、環境分析：嘧磺隆是磺酰脲類除草劑中的典型品種之一，最早由美國杜邦公司Geroge?Levitt等人研究開發成功，1982年在美國實現了商品化，我國90年代初開始研究，引進這一新型農藥品種和生產技術，目前已有小批量生產并投入使用。
該農藥主要用作林地和非耕地除草劑，農田禁用，由于嘧磺隆能抑制植物根部細胞分裂而阻止植物生長，嚴重時可使植物葉部失綠而壞死，所以，隨著這一新型農藥的生產和應用，必然會帶來一些環境（尤其是水體、農業和生態環境等）問題。因此，研究嘧磺隆的環境污染監測方法顯得必要。
1、主要儀器與試劑
SY5000型高效液相色譜儀；UV-1型254nm紫外光檢測器和3390A型記錄儀。
嘧磺隆標準貯備液：400mg/L。準確稱取嘧磺隆標準0.0400g。溶入二氯甲烷，轉入100ml容量瓶并定容。嘧磺隆標準使用液：40mg/L。準確移取10.0ml貯備演于l00ml容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。所用其它試劑為分析純或優級純。
2、色譜條件
色譜柱為內徑4mm，長30cm，裝填固定相l8烷基硅烷（ODS，?的不銹鋼柱。流動相為甲酵85％、水15％，流速1.0ml/min，柱溫28℃，檢測器波長254nm．走紙速度5ram/min。
3、水樣萃取富集方法
取1000ml水樣于1000ml分液漏斗中，?加入5ml10％（v/v）硫酸，15ml二氯甲烷，搖動5min，中途放氣2-3次，靜置30min，下層有機相轉入25ml容量瓶中，水相再用10ml二氯甲烷重復萃取一次，兩次萃取液合并，并用二氯甲烷定容至25ml刻度，搖勻備測。
4、工作曲線
于各盛l000ml自來水的七個分液漏斗中，分別加入0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml嘧磺隆標準使用液，然后按水樣萃取方法萃取并測定，用計算器統計出回歸方程，樣品以此定量。
5、結果與討論
（1）色譜分離條件的選擇
研究發現，在甲醇為85％、水為15％、柱溫為28℃、流速為1.0ml/min、走紙速度為5mm/min的條件下，嘧磺隆與溶劑二氯甲烷等能很好分離。
（2）萃取條件研究
萃取劑及溶劑的選擇
先后試驗了石油醚、三氯甲烷、四氯化碳、二氯甲烷等對嘧磺隆的萃取性能和在色譜中溶劑與溶質的分離性能，最后選擇用二氯甲烷為萃取劑，同時，配制嘧磺隆標準時，用二氯甲烷作溶劑。
酸度對萃取率的影響
實驗發現，只有在酸性溶液中，嘧磺隆才能被二氯甲烷萃取，其萃取效率隨酸度變化。隨著酸度提高，萃取效率迅速增加，pH<3.5時，萃取率達最大且恒定不變，以后萃取選擇pH=2-3。
搖動時間對萃取率的影響
在相同的實驗條件下試驗了萃取時間對萃取率的影響。結果表明，搖動時間長于3min，萃取率趨于恒定，以后搖動萃取時間選擇5min。
萃取次數對萃取率的影響
試驗了25ml二氯甲烷分一次萃取和兩次（第一次15ml，第二次10ml）萃取對萃取率的影響，結果表明，一次萃取的平均萃取率為95％，二次萃取的平均萃取率為100.3％，以后實驗萃取2次。
靜置時間的影響
實驗表明，二氯甲烷與水相充分分層需30min。
（3）實際樣品測定
用本方法可以測定嘧磺隆生產廠總排放口廢水和附近農田井水（懷疑受污染）。結果表明，樣品測定的最大相對標準偏差為5％，加標回收率在93%-107％之間，可見，方法具有可靠的準確度和較高的精密度。
（4）最低檢測量和最低檢測濃度
按2倍噪音響應信號算得本方法最低檢測量為2ng。根據連續五天全程序空白值，求得本方法最低檢出濃度為0.004mg/L。
五、無機分析等：高效液相色譜在有機分析中已取得了很大成功，但在無機分析中的應用研究起步較晚，至今尚沒有從理論上徹底研究過。盡管如此，近年來，人們對HPLC在無機分析中的應用越來越感興趣，這是因為無機分析中所分析的金屬離子要轉換成以金屬有機化合物或金屬整合物的形式測定，而這些化合物大多是缺少足夠的揮發性和熱穩定性，在用氣相色譜法（GC）時，在柱操作溫度下被測化合物很可能分解，而HPLC的明顯優點是可以在常溫下操作，各種分離方式，如：正相、反相、反相離子對、離子交換和排阻色譜等都是有效的分離手段。多元流動相、膠束流動相等的使用，進一步擴大了HPLC的應用范圍。各種檢測方法的研究，提高了分析的靈敏度。
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